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前言
本标准代替GB/T 4789.5-2003《食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验》。
本标准与 GB/T 4789.5-2003 相比，主要变化如下：
——修改了标准名称；
——修改了培养基和试剂；
——修改了操作步骤中增菌部分和生化试验及附加生化试验部分；
——修改了表2
——修改了表4
食品安全国家标准
食品微生物学检验 志贺氏菌检验
1 范围
本标准规定了食品中志贺氏菌(Shigella)的检验方法。
本标准适用于食品中志贺氏菌的检验。。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
a） 恒温培养箱：36 ℃ 1 ℃；
b） 冰箱：2 ℃～5 ℃；
c） 膜过滤系统；
d） 厌氧培养装置：41.5 ℃?1 ℃；
e） 电子天平：感量 0.1 g；
f） 显微镜：10 ～100 ；
g） 均质器；
h） 振荡器；
i） 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头；
j） 无菌均质杯或无菌均质袋：容量 500 mL；
k） 无菌培养皿：直径 90 mm；
l） pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸；
m） 全自动微生物生化鉴定系统。
3? 培养基和试剂
3.1 志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：见附录 A 中 A.1。
3.2? 麦康凯（MAC）琼脂：见附录 A中 A.2。
3.3? 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（XLD）琼脂：见附录 A 中 A.3。
3.4? 志贺氏菌显色培养基。
3.5 三糖铁（TSI）琼脂：见附录 A中 A.4。
3.6? 营养琼脂斜面：见附录 A? 中 A.5。
3.7 半固体琼脂：见附录 A 中 A.6。
3.8 葡萄糖铵培养基：见附录 A中 A.7。
3.9? 尿素琼脂：见附录 A中 A.8。
3.10? β-半乳糖苷酶培养基：见附录 A中 A.9。
3.11 氨基酸脱羧酶试验培养基：见附录 A中 A.10。
3.12 糖发酵管：见附录 A 中 A.11。
3.13 西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录 A中 A.12。
3.14 粘液酸盐培养基：见附录 A 中 A. 13。
3.15 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录 A中 A.14。
3.16 志贺氏菌属诊断血清。
3.17 生化鉴定试剂盒。
4 检验程序
志贺氏菌检验程序见图 1。
5? 操作步骤
5.1 增菌
以无菌操作取检样 25 g（mL），加入装有灭菌 225 mL 志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片式均 质器以 8 000 r/min～10 000 r/min 均质；或加入装有 225 mL 志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，用拍击式均质 器连续均质 1 min～2 min，液体样品振荡混匀即可。于 41.5 ℃±１℃，厌氧培养 16 h～20 h。
5.2 分离
取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于 XLD 琼脂平板和 MAC 琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板 上，于 36 ℃±1 ℃培养 20 h～24 h，观察各个平板上生长的菌落形态。宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大 于其他志贺氏菌。若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至 48 h 再进行观察。志贺氏菌在 不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表 1。
5.3 初步生化试验
5.3.1自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种TSI、半固体和营养琼脂斜面各一 管，置36 ℃±1 ℃培养20 h～24 h，分别观察结果。
5.3.2 凡是三糖铁琼脂中斜面产碱、底层产酸（发酵葡萄糖，不发酵乳糖，蔗糖）、不产气（福氏志贺氏 菌6型可产生少量气体）、不产硫化氢、半固体管中无动力的菌株，挑取其5.3.1中已培养的营养琼脂斜面 上生长的菌苔，进行生化试验和血清学分型。
5.4 生化试验及附加生化试验
5.4.1 生化试验
用 5.3.1 中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验，即 β-半乳糖苷酶、尿素、赖氨酸脱 羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷和七叶苷的分解试验。除宋内氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌 13 型的鸟氨酸 阳性;宋内氏菌和痢疾志贺氏菌 1 型，鲍氏志贺氏菌 13 型的 β-半乳糖苷酶为阳性以外，其余生化试验志贺 氏菌属的培养物均为阴性结果。另外由于福氏志贺氏菌 6 型的生化特性和痢疾志贺氏菌或鲍氏志贺氏菌相 似，必要时还需加做靛基质、甘露醇、棉子糖、甘油试验，也可做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧 化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得 判定为志贺氏菌属。志贺氏菌属生化特性见表 2。
5.4.2 附加生化实验
由于某些不活泼的大肠埃希氏菌（anaerogenic E.coli）、A-D（Alkalescens-D isparbiotypes 碱性-异型） 菌的部分生化特征与志贺氏菌相似，并能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集；因此前面生化实验符合志贺 氏菌属生化特性的培养物还需另加葡萄糖胺、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验(36 ℃培养 24 h～48 h)。志 贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D 菌的生化特性区别见表 3。
5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据5.3.2的初步判断结果，用5.3.1中已培 养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。
5.5 血清学鉴定
5.5.1抗原的准备
志贺氏菌属没有动力，所以没有鞭毛抗原。志贺氏菌属主要有菌体（O）抗原。菌体 O 抗原又可分为 型和群的特异性抗原。
一般采用 1.2%～1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。
注 1：一些志贺氏菌如果因为 K 抗原的存在而不出现凝集反应时，可挑取菌苔于 1 mL 生理盐水做成浓菌液，100 ℃煮 沸 15 min～60 min 去除 K 抗原后再检查。
注 2：D 群志贺氏菌既可能是光滑型菌株也可能是粗糙型菌株，与其他志贺氏菌群抗原不存在交叉反应。与肠杆菌科不 同，宋内氏志贺氏菌粗糙型菌株不一定会自凝。宋内氏志贺氏菌没有 K 抗原。
5.5.2 凝集反应
在玻片上划出 2 个约 1cm×2cm 的区域，挑取一环待测菌，各放 1/2 环于玻片上的每一区域上部，在其 中一个区域下部加 1 滴抗血清，在另一区域下部加入 1 滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分 别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合 1 min，并对着黑色背景进行观察，如果抗血清 中出现凝结成块的颗粒，而且生理盐水中没有发生自凝现象，那么凝集反应为阳性。如果生理盐水中出现 凝集，视作为自凝。这时，应挑取同一培养基上的其他菌落继续进行试验。
如果待测菌的生化特征符合志贺氏菌属生化特征，而其血清学试验为阴性的话，则按 5.5.1 注 1 进行 试验。
5.5.3 血清学分型（选做项目）
先用四种志贺氏菌多价血清检查，如果呈现凝集，则再用相应各群多价血清分别试验。先用 B 群福氏 志贺氏菌多价血清进行实验，如呈现凝集，再用其群和型因子血清分别检查。如果 B 群多价血清不凝集， 则用 D 群宋内氏志贺氏菌血清进行实验，如呈现凝集，则用其Ⅰ相和Ⅱ相血清检查；如果 B、D 群多价血 清都不凝集，则用 A 群痢疾志贺氏菌多价血清及 1～12 各型因子血清检查，如果上述三种多价血清都不凝 集，可用 C 群鲍氏志贺氏菌多价检查，并进一步用 1～18 各型因子血清检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的 型抗原和群抗原鉴别见表 4。
5.6 结果报告
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告 25 g（mL）样品中检出或未检出志贺氏菌。
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